建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室勢(shì)在必行

發(fā)布時(shí)間:2020.05.06 瀏覽次數(shù):

臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域:試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配置和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染,進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行,即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)—標(biāo)本制備區(qū)—擴(kuò)增反應(yīng)混合物配置和擴(kuò)增區(qū)—擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

 

各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

 

實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制:

 

PCR實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求,但是為了避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí),要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。

 

 

1.試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

 

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū),不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的控制,本區(qū)并沒(méi)有嚴(yán)格的要求。

 

 

2.標(biāo)本制備區(qū)

 

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、儲(chǔ)存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

 

 

 

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?,以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

 

 

3.擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

 

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外,已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中,通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管,因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

 

實(shí)驗(yàn)室PCR

 

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓,以避免氣溶膠在本區(qū)漏出,為避免氣溶膠所致的污染,應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

 

 

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

 

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè),此區(qū)域可不設(shè)。

 

 

 

本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源,因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓,以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)

 

污染的預(yù)防和控制

 

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中,常見(jiàn)的有以下幾種污染類型:擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染,實(shí)驗(yàn)就必須停止,直到找到污染源為止,而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢,需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣,浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染,首先應(yīng)是預(yù)防,而不是排除。

 

 

1.工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

 

(1)各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理;

 

(2)各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等),以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

 

 

2.合理的系統(tǒng)設(shè)置

 

(1)合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置,盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);

 

(2)嚴(yán)格的氣流壓力控制,保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

 

 

3.規(guī)范的操作

 

(1)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn),經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作;

 

(2)在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中,操作者必須戴手套,并經(jīng)常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施;

 

(3)清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后,必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈照射消毒外,對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

 

 

4.嚴(yán)格的管理

 

(1)嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室,有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門;

 

(2)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色),當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其他區(qū)域;

 

(3)盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性;

 

(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源,廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒,必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉,用過(guò)的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理,如焚燒等;

 

(5)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì),應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

 

 

5.完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施

 

完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件,應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器,如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。

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